摘要

本文采用高效化學(xué)轉(zhuǎn)化重組法成功構(gòu)建了重組腺病毒，詳細(xì)描述了實(shí)驗材料、方法以及結(jié)果。通過對構(gòu)建體系的優(yōu)化，提高了陽性重組率，為抗腫瘤生物治療制劑的制備奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)。該法具有成本低、效率高、操作簡便等優(yōu)勢，具有廣闊的應(yīng)用前景。

引言

重組腺病毒作為基因治療的重要載體，因其宿主細(xì)胞范圍廣、轉(zhuǎn)移效率高、滴度高及表達(dá)水平高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于腫瘤基因治療、基因功能研究及疫苗開發(fā)等領(lǐng)域。然而，傳統(tǒng)的重組腺病毒構(gòu)建方法步驟繁瑣、成本高且陽性重組率低，限制了其廣泛應(yīng)用。因此，優(yōu)化重組腺病毒的構(gòu)建方法，提高構(gòu)建效率及陽性重組率，對于推進(jìn)基因治療研究具有重要意義。本研究采用高效化學(xué)轉(zhuǎn)化重組法，旨在簡化構(gòu)建流程，提高構(gòu)建效率，為制備具有更高抗腫瘤療效的生物治療制劑奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1. 材料

• 質(zhì)粒：穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV、腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1、攜帶目的基因的質(zhì)粒（如p21基因質(zhì)粒、pcDNA3.0-survivin）。

• 菌株：大腸桿菌DH5α、BJ5183（含腺病毒骨架質(zhì)粒）。

• 細(xì)胞：人胚腎293細(xì)胞。

• 試劑：某試劑PmeⅠ、PacⅠ內(nèi)切酶，某試劑酚:氯仿，某試劑乙醇，某試劑脂質(zhì)體LipofectamineTM2000，某試劑DNA聚合酶，某試劑PCR純化試劑盒，某試劑凝膠回收試劑盒，某試劑低熔點(diǎn)瓊脂糖，某試劑總蛋白裂解酶，某試劑蛋白酶抑制劑，某試劑β-半乳糖苷酶檢測試劑盒，某試劑T4 DNA連接酶。

• 儀器：某品牌PCR儀，某品牌電泳儀，某品牌離心機(jī)，某品牌超凈工作臺，某品牌倒置顯微鏡，某品牌超速離心機(jī)，某品牌超濾管，某品牌實(shí)時熒光定量PCR儀。

2. 方法

2.1 構(gòu)建重組腺病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒

1. PCR擴(kuò)增目的基因：以攜帶目的基因的質(zhì)粒為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因全長序列。在5'端和3'端PCR引物中分別引入特定的酶切位點(diǎn)。

2. 酶切與連接：將PCR產(chǎn)物及穿梭質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，回收目的基因片段及穿梭質(zhì)粒載體片段，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒。

3. 轉(zhuǎn)化與鑒定：將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過PCR及酶切鑒定篩選出陽性克隆，并進(jìn)行測序驗證。

2.2 同源重組構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒

1. 線性化穿梭質(zhì)粒：用PmeⅠ酶切重組穿梭質(zhì)粒，回收線性化穿梭質(zhì)粒。

2. 化學(xué)轉(zhuǎn)化法同源重組：將線性化穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，篩選出陽性克隆。

3. 鑒定與純化：通過PacⅠ酶切鑒定同源重組成功的質(zhì)粒，并用大抽質(zhì)粒試劑盒進(jìn)行大量質(zhì)粒抽提。

2.3 包裝與擴(kuò)增重組腺病毒

1. 線性化重組腺病毒質(zhì)粒：用PacⅠ酶切重組腺病毒質(zhì)粒，回收線性化質(zhì)粒。

2. 脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞：將線性化質(zhì)粒用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，進(jìn)行包裝。

3. 觀察與收集病毒：觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE），收集病變細(xì)胞，通過反復(fù)凍融、離心等方法制備病毒上清。

2.4 病毒純化與滴度測定

1. 病毒純化：采用碘克沙醇密度梯度離心或?qū)游龇兓《尽?/p>

2. 滴度測定：通過實(shí)時熒光定量PCR法測定病毒滴度。

實(shí)驗結(jié)果

1. 重組腺病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒的構(gòu)建

成功構(gòu)建了攜帶目的基因的重組腺病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，通過PCR及酶切鑒定，證實(shí)目的基因已成功插入穿梭質(zhì)粒中。

2. 同源重組構(gòu)建重組腺病毒質(zhì)粒

采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法，成功實(shí)現(xiàn)了穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒的同源重組，通過PacⅠ酶切鑒定，篩選出陽性克隆，獲得了重組腺病毒質(zhì)粒。

3. 包裝與擴(kuò)增重組腺病毒

將重組腺病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，觀察到明顯的CPE，收集病變細(xì)胞制備病毒上清。通過反復(fù)凍融、離心等方法，成功獲得了重組腺病毒顆粒。

4. 病毒純化與滴度測定

采用碘克沙醇密度梯度離心或?qū)游龇兓《荆@得了高純度的重組腺病毒。通過實(shí)時熒光定量PCR法測定病毒滴度，結(jié)果顯示病毒滴度達(dá)到較高水平。

討論

1. 高效化學(xué)轉(zhuǎn)化重組法的優(yōu)勢

本研究采用高效化學(xué)轉(zhuǎn)化重組法構(gòu)建重組腺病毒，相比傳統(tǒng)方法，具有以下優(yōu)勢：

• 簡化流程：減少了繁瑣的步驟，提高了構(gòu)建效率。

• 降低成本：減少了試劑及材料的消耗，降低了實(shí)驗成本。

• 提高陽性重組率：通過優(yōu)化同源重組條件，提高了陽性重組率，確保了實(shí)驗的可靠性。

2. 實(shí)驗策略的創(chuàng)新性

• 引入化學(xué)轉(zhuǎn)化法：將化學(xué)轉(zhuǎn)化法應(yīng)用于同源重組，提高了重組效率。

• 優(yōu)化純化方法：采用碘克沙醇密度梯度離心或?qū)游龇兓《荆岣吡瞬《镜募兌燃暗味取?/p>

• 多基因檢測：通過構(gòu)建攜帶不同目的基因的重組腺病毒，驗證了該方法的通用性及適用性。

3. 應(yīng)用前景

重組腺病毒作為基因治療的重要載體，具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究構(gòu)建的高效化學(xué)轉(zhuǎn)化重組法，為制備具有更高抗腫瘤療效的生物治療制劑奠定了堅實(shí)基礎(chǔ)。該方法可廣泛應(yīng)用于腫瘤基因治療、基因功能研究及疫苗開發(fā)等領(lǐng)域，具有重要的理論意義及實(shí)用價值。

結(jié)論

本研究采用高效化學(xué)轉(zhuǎn)化重組法成功構(gòu)建了重組腺病毒，通過優(yōu)化構(gòu)建流程，提高了陽性重組率及構(gòu)建效率。該方法具有成本低、效率高、操作簡便等優(yōu)勢，為抗腫瘤生物治療制劑的制備提供了有力支持。未來，將進(jìn)一步探索該方法的優(yōu)化及應(yīng)用，為基因治療研究做出更大貢獻(xiàn)。